Worth Weighting for - Studies on Benchmark Dose Analysis in Relation to Animal Ethics in Toxicity Testing

A purpose of chemical health risk assessment is to characterize the nature and size of the health risk associated with exposure to chemicals, including identification of a dose below which toxic effects are not expected or negligible. This is usually based on analysis of doseresponse data from toxicity studies on animals. Traditionally the dose-response in animals has been analyzed employing the No-Observed-Adverse-Effect-Level (NOAEL) approach, but because of the several flaws of this approach it is to a greater and greater extent being replaced by the so called Benchmark Dose (BMD) approach. Previous evaluations of how to design studies in order to obtain as much information as possible from a limited number of experimental animals have revealed the importance of including high doses. However, these studies have not taken the distress of the laboratory animals, which is likely to be higher at high doses, into account. The overall aim of the present thesis was to examine how study designs, especially with dose groups of unequal size, affect the quality of BMD estimates and level of animal distress. In Paper I our computer simulations concerning the appropriateness of using nested models in BMD modelling of continuous endpoints indicate that it is problematic to calculate BMD on the basis of simpler models and that they should be used with caution in connection with risk assessment as they may result in underestimations of the true BMD. In Paper II-III our computer simulations of toxicity testing with unequal group sizes showed that better information about dose-response can be obtained with designs that also reduce the level of animal distress. In Paper IV we interviewed members of the Swedish Animal Ethics Committees concerning how the number of animals used in toxicity tests might be weight against the distress of the individual animal. Their opinions concerning whether it is preferable to use fewer animals that suffer more rather than a large number of animals that suffer a little, differed considerably between individuals. However, there were no statistically significant differences in relation to the fact that respondent were either researchers, political representatives or representatives of animal welfare organizations. In Paper V the results from Paper IV and the simulation techniques in Paper II were combined to evaluate how toxicity tests could be designed to obtain as much information as possible at a limited ethical cost, with respect to both the number of animals used and their individual distress. The most ethically efficient design depended on what constituted the ethical cost and how large that ethical cost was. In conclusion, this thesis describes the potential to use BMD-aligned study design as a mean for refinement of animal toxicity testing. In addition, new strategies for model selection and quantitative measures of ethical weights are presented. POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING Vi utsätts ständigt i olika grad för kemikalier som potentiellt kan vara skadliga för oss. Hälsoriskbedömningar av dessa kemikalier görs för att avgöra när åtgärder behöver sättas in för att begränsa vår exponering. Riskbedömningarna mynnar ofta ut i sättandet av riktvärden, såsom acceptabla dagliga intag. Riktvärdena baseras ofta på djurförsök där man identifierar NOAEL-värden, dvs. den högsta dos som inte ger en statistiskt säkerställd effekt. NOAEL metodiken har dock brister och därför använder allt fler Benchmark Dos (BMD) metoden. En fördel med BMD-metoden är att den tar hänsyn till osäkerheter i data på ett bättre sätt. Flera tidigare undersökningar har studerat hur man designar ett toxikologiskt försök för att få ut så mycket information som möjligt. Dessa studier har utgått ifrån ett bestämt totalt antal försöksdjur och bland annat visat att det är viktigt att det förekommer höga doser i försöken. Dock har inga tagit hänsyn till de etiska aspekterna av försöket. I samband med toxikologiska tester är det till exempel rimligt att tänka sig att djur som utsätts för en hög dos lider mer än djur som får en lägre dos. Det övergripande målet var därför att studera hur designen av toxikologiska försök kan förbättras så att likvärdig, eller bättre, information kan tas fram med lika mycket eller mindre lidande hos försöksdjuren. Under arbetet med våra datasimuleringar observerade vi att den vedertagna BMD-metodiken i vissa fall kan leda till värden som underskattar risken. I studie I undersökte vi varför, hur ofta och när detta inträffar. Vi visade att fenomenet uppkommer när alltför enkla matematiska modeller väljs för att beskriva sambandet mellan dos och effekt. I studie II-III har vi med datorsimuleringar undersökt förhållandet mellan kvalitén på den information man får från ett toxikologiskt och hur försöket läggs upp. Vi visade att i flera fall kan kvaliteten på denna information förbättras samtidigt som djurlidandet minskas. I studie IV intervjuade vi ledamöterna i de svenska djurförsöksetiska nämnderna om hur tecken på djurs lidande bör värderas etiskt. Vilket är det minst dåliga alternativet; att ha ett fåtal djur som utsätts för ett större lidande eller att använda fler djur som lider mindre? Individuella ledamöter resonerade väldigt olika kring dessa frågor. Vi såg dock inga säkra skillnader mellan forskare, politiker eller representanter från djurskyddsorganisationer. I studie V kombinerade vi resultaten från studie IV med datorsimuleringarna från studie II för att undersöka hur ett toxikologiskt försök skulle kunna läggas upp för att få ut mest information givet en fast etisk kostnad för försöket, där den etiska kostnaden var beroende både av antalet djur i försöket och av djurens lidande. Det visade sig att det finns potentiella etiska vinster i förändrad studiedesign, beroende på hur den etiska kostnaden definieras. Sammantaget visar avhandlingen att det finns en potential att minska djurs lidande utan att förlora vetenskaplig information genom att använda moderna metoder för dos-responsanalys samt att djurförsök kan värderas både utifrån antalet djur och utifrån deras lidande. LIST OF SCIENTIFIC PAPERS I. Ringblom J, Johanson G, Öberg M. Current Modeling Practice May Lead to Falsely High Benchmark Dose Estimates. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2014 Jul;69(2):171-7 II. Kalantari F*, Ringblom J*, Sand S, Öberg M. Influence of Distribution of Animals between Dose Groups on Estimated Benchmark Dose and Animal Distress for Quantal Responses. Accepted for publication by Risk Analysis. III. Ringblom J, Kalantari F, Johanson G, Öberg M. Influence of Distribution of Animals between Dose Groups on Estimated Benchmark Dose and Animal Distress for Continuous Effects. Manuscript. IV. Ringblom J, Törnqvist E, Hansson S-O, Rudén C, Öberg M. Assigning ethical weights to clinical signs observed during toxicity testing. ALTEX. 2016 Jul 21. doi: 10.14573/altex.1512211. [Epub ahead of print] V. Ringblom J, Johanson G, Öberg M. Dose-Response Simulations Suggest that Toxicity Tests may be Optimized in Relation to the Ethical Cost. Manuscript. *=These authors contributed equally to this work. CONTENTS